تولید گیاه توتون مقاوم به ویروس PVX با استفاده از مکانیسم RNA Silencing

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی دانشگاه شهید مدنی آذربایجان.

2 دانشیار گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه شهید مدنی آذربایجان.

3 دانشیار گروه گیاهپزشکی دانشکده کشاورزی دانشگاه شهید مدنی آذربایجان.

4 استادیار گروه زیست شناسی گیاهی دانشکده علوم طبیعی دانشگاه تبریز.

چکیده

چکیده
یکی از مهم­ترین ویروس­های بیماری­زای خانواده سولاناسه ویروس (PVX)Potato X virus  می­باشد که سبب ایجاد لکه­های موزاییک سیستمیک در توتون (Nicotiana tabacum L.) و خسارت اقتصادی به آن می­شود. بهترین روش مدیریت این بیماری استفاده از ارقام مقاوم توتون است. در این تحقیق جهت ایجاد گیاهان توتون مقاوم به PVX ابتدا سازه سنجاق­سری قطعه­ای 400 نوکلوتیدی از ژن P25 این ویروس که ممانعت کننده از RNA Silencing در گیاه است، ساخته شد. برای این کار قطعه ژن P25 به روش PCR با آغازگرهای اختصاصی تکثیر و در دو مرحله، در دو جهت سنس و آنتی­سنس در ناقل pFGC5941 همسانه سازی شد. در مرحله بعد، سازه RNAi از روی این ناقل نوترکیب به واسطه­ آگروباکتریوم، به ریزنمونه­های (قطعات برگ) گیاهان توتون رقم سامسون انتقال یافت و گیاهان تراریخته با گزینش روی محیط کشت حاوی بستا بدست آمده که پس از تکثیر مورد بررسی­های فنوتیپی و مولکولی قرار گرفتند. بررسی مولکولی با PCR روی DNA گیاهان، وجود تراژن را تایید کرد. نسل بعدی گیاهان تراریخته در گلخانه به روش مکانیکی با PVX تلقیح شدند. نتایج ELISA با آنتی­بادی اختصاصی پروتئین پوششیPVX مقاومت سه لاین تراریخته را نشان داد. تایید مولکولی این سه لاین مقاوم توتون به PVX با استفاده از RT-PCR روی RNA استخراج شده از گیاهان به­کمک آغازگرهای CP ویروس انجام شد و ویروس در گیاهان تراریخت ردیابی نگردید. نتیجه این تحقیق منجر به تولید سه لاین مستقل توتون مقاوم به PVX شد که بررسی مقاومت آنها در شرایط مزرعه در حال انجام می­باشد.
 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Production of Tobacco Plant Resistant to PVX by RNA Silencing Mechanism

نویسندگان [English]

  • Mohsen Sajadifard 1
  • Maghsoud Pajohandeh 2
  • Akbar Shirzad 3
  • Haniyeh Mohajjel Shoja 4
1 Former MSc. Student in Biotechnology, Azarbaijan Shahid Madani University.
2 Associate Prof. Department of Biotechnology, Faculty of Agriculture, Azarbaijan Shahid Madani University.
3 Associate Prof. Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Azarbaijan Shahid Madani University.
4 Assistance Prof. Department of Plant Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz.
دیدار ن، پژوهنده پ و محمودی ف، 1393. ایجاد گیاهان زودگل­ده آرابیدوپسیس از طریق خاموش کردن ژن CLF به روش RNA silencing. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی، دوره 6، شماره 2، ص 74-61 .
Ai T, Zhang L, Gao Z, Zhu CX and Guo X, 2011. Highly efficient virus resistance mediated by artificial microRNAs that target the suppressor of PVX and PVY in plants. Plant Biology 13:304-16.
Ares X,  Calamante  G,  Cabral  S,  Lodge  J,  Hemenway P, Beachy R N and  Mentaberry A, 1998. Transgenic plants expressing potato virus X ORF2 protein (P24) are resistant to tobacco Mosaic virus and other tobamoviruses. Journal of Virology, 72:731-738.
Bai Y, Guo Z, Wang X, Bai D and Zhang W, 2009. Generation of double-virus-resistant marker-free transgenic potato plants. Progress in Natural Science, 19:543-548.
Beemster ABR and de Bokx J A 1987. Survey of properties and symptoms. PP. 84-113. In: de Bokx JA and van der Want JPH (eds.) Viruses of Potato and Seed Potato Production.  Pudoc. Wageningen, Netherlands.
Chen JF, Murchison EP and Tang R, 2008. Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure. Proc. Natl Acad Sci USA, 105 (6): 2111–6­.
Chiu MH, Chen IH, Baulcombe DC and Tsai CH,  2010. The silencing suppressor P25 of Potato virus X interacts with Argonaute1 and mediates its degradation through the proteasome pathway. Molecular Plant Pathology, 11:641-9.
Chomczynski P and Sacchi N, 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 162:156-9.
Cockerham G. 1958. Experimental breeding in relation to virus resistance.Proceedings of the Third Conference on Potato Virus Disease, Lisse-Wageningen. pp.199-203.
Doyle JJ and Doyle JL, 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemistry Bulletin, 19:11-15.
Duan CG, Wang CH, and Guo HS, 2012. Application of RNA silencing to plant disease resistance. Silence, 3(1):5. doi:10.1186/1758-907X-3-5.
Forootani S, Jafarpour B, Falahati Rastegar M and Beigzadeh N. 2004. Identification of races 1 and 3 of PVX in Khorasan and Ardebil Provinces. P. 222. Proceedings of the 16th. Iranian Plant Protection Congress,Vol. II. Plant Diseases. 29 Aug- 2 Sep.Tabriz University, Tabriz, Iran.
Friedman RC, Farh KK, Burge CB and Bartel DP, 2009 .Most mammalian mRNAs are conserved targets of microR NAs.Genome Res, 19: 92-105.
Hock J and Meister G, 2008. The Argonaute protein family. Genome Biology, 9: 1-8.
Hutvagner G and Zamore PD, 2002. RNAi: nature abhors a double- strand. Current Opinion in Genetics and Development, 12: 225-232.
Kohm BA, Goulden MG, Gilbert JE, Kavanagh TA and Baulcombe  DC, 1993. A potato virus X resistance gene mediates an induced, nonspecific resistance in protoplasts. Plant Cell, 5:913-920.
Longstaff M, Brigneti G, Boccard F, Chapman S and Baulcombe D, 1993. Extreme resistance to potato virus X infection in plants expressing a modified component of the putative viral replicase. EMBO Journal, 12:379-86.
Moissiard G and Voinnet O, 2004. Viral suppression of RNA silencing in plants. Mol Plant Pathology, 5:71-82.
Murashige T and Skoog F, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15:473-497.
Paddison P, Caudy A and Hannon G, 2002. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA,  99 (3): 1443–8.
Pazhouhandeh M, 2009. Virus and RNA Silencing. Lambert Academic Publishing (LAP), Germany.
Pazhouhandeh M, Dieterle M, Marrocco K, Lechner E, Berry B, Brault V, Hemmer O, Kretsch T, Richards KE, Genschik P and Ziegler-Graff V. 2006. F-box-like domain in the Polerovirus protein P0 is required for silencing suppressor function. Proc Natl Acad Sci USA,103:1994-1999.
Roy G, Sudarshana MR, Ullman DE, Ding SW, Dandekar AM and Falk BW, 2006. Chimeric cDNA Sequences from Citrus tristeza virus Confer RNA Silencing-Mediated Resistance in Transgenic Nicotiana benthamiana Plants. Phytopathology. 96:819-27.
Salazar LF, 1996. Potato Viruses and Their Control. International Potato Center. Peru. 214 pp.
Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T, 1989. Molecular cloning; a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.
Sanford JC. and Johnston SA. 1985. The concept of pathogene derived resistance. J. Theoret. Biol, 113: 395-405.
Sivparsad BJ and Gubba A, 2014. Development of transgenic sweet potato with multiple virus resistance in South Africa (SA). Transgenic Research, 23:377-88.
Tehseen M, Imran M, Hussain M, Irum Sh, Ali Sh, Mansoor Sh and Zafar Y, 2010. Development of male sterility by silencing Bcp1 gene of Arabidopsis through RNA Viruses of Potato and Seed Potato Production, Second ed. Production. PUDOC, Viruses of Potato and Seed Potato Production, Second ed. PUDOC.
Verchot-Lubicz J, Ye CM and Bamunusinghe D. 2007, Molecular biology of Potexviruses: recent advances. Journal of General Virology, 88:1643-55.